Jak wszyscy to wszyscy

tl;dr, wyjątkowo długi. Napisałem artykuł (naukowy) o Covidzie, który wykorzystuję tu jako pretekst żeby opowiedzieć Wam o genach HLA (no i żeby się pochwalić, oczywiście).

Wszyscy rzucili się na kowida. Kardiolodzy, endokrynolożki, ekonomiści, osteopaci, dentyści (nie żartuję!) – wszyscy teraz piszą prace o Covidzie. Oczywiście, częściowo z bardzo przyziemnych powodów: artykuły o kowidzie mają teraz dużą widoczność i łatwiej je umieścić w dobrych czasopismach, oraz na badania kowida znalazło się dużo pieniędzy. Ale wbrew cynikom, przede wszystkim panuje atmosfera „wszystkie ręce na pokład”.

Trochę przez przypadek trafiło też na mnie – nie wymyśliłem badania, o którym Wam dzisiaj opowiem, ale znalazłem się pod ręką gdy trzeba było je przeprowadzić. No i też akurat przypadkiem miałem pod ręką narzędzia, dzięki którym z tego badania w ogóle coś wyszło – nie moja zasługa, tylko splot sprzyjających okoliczności. Nasze badanie można podsumować jednym zdaniem: istnieje wariant jednego z genów HLA, który istotnie zwiększa ryzyko ciężkiego przebiegu choroby COVID-19. Osoby posiadające ten wariant dwa razy częściej trafiają pod respirator i na oddział intensywnej terapii. Być może takich wariantów jest więcej, ale my jesteśmy pewni tylko co do tego jednego.

Zacznijmy od HLA. HLA, czyli „human leukocyte antigen”, ludzki antygen leukocytarny, to białka pełniące bardzo ważną funkcję w naszej odporności, kodowane przez kilka różnych genów. Każdy z tych genów ma swoje liczne warianty, czyli allele. Allele różnią się od siebie sekwencją, a czasem też funkcją. Wszyscy dobrze znamy jeden przykład genu o różnych allelach: gen ABO. Ponieważ każdy z nas jedną kopię genu od każdego z rodziców, możemy mieć dwa różne allele genu ABO. Osoba posiadające dwa identyczne allele, O i O będzie miała grupę krwi 0. Osoba posiadająca jeden allel A, a drugi B, będzie miała grupę krwi AB. Z allelami HLA jest podobnie, z tym, że po pierwsze, jest wiele genów HLA, a po drugie, tych alleli jest również o wiele więcej.

Białka tworzone na podstawie genów HLA wchodzą w skład kompleksu MHC (głównego układu zgodności tkankowej, major histocompatibility complex) i służą do prezentowania antygenów na powierzchni naszych komórek. Co to znaczy?

Każda komórka w naszym organizmie prezentuje na swojej powierzchni wszystkie białka które wytwarza. W ten sposób komórki naszego układu odpornościowego rozpoznają, na przykład, komórki które zostały zainfekowane wirusem. Co to właściwie znaczy, „prezentuje”? Nasze komórki to pęcherzyki otoczone cienką podwójną warstewką tłuszczu¹, powierzchnia to właśnie ten tłuszcz. Niektóre białka są w stanie w tym tłuszczu „pływać”, ale większość nie: żeby znaleźć się na powierzchni, a jednocześnie nie odpłynąć w siną dal muszą zostać przytrzymane chwytakiem, który osadzony jest w błonie komórkowej. Te chwytaki to właśnie kompleks MHC, którego zasadniczą częścią jest białko będące produktem genów HLA. Oprócz tego MHC nie prezentuje całego białka, tylko jego krótkie kawałki – peptydy. Białko zostaje pocięte na kawałki wewnątrz komórki, kawałki zostają wyłapane przez odpowiednią część chwytaka – kodowaną przez HLA, a potem chwytak wędruje na powierzchnię komórki.

Kompleks MHC zawiera uchwyty dla limfocytów T, które je łapią, żeby wymacać prezentowany peptyd. Limfocyty T mają bowiem na swojej powierzchni specjalne receptory, które wymacują prezentowane peptydy. Receptory te przypominają przeciwciała, są niezwykle zmienne² i nigdy nie pasują do żadnych białek czy peptydów produkowanych przez organizm z którego pochodzą³. Jeśli więc rozpoznają prezentowany przez MHC peptyd, to znaczy, że pochodzi on z obcego białka: to może być zmutowane białko komórki rakowej albo białko wirusa Sars-Cov-2, który zainfekował komórkę.

Typowym losem takiej komórki⁴ jest napotkanie na swej drodze limfocytu T cytotoksycznego. Ups, skomplikowana nazwa. Zapamiętajcie lepszą: limfocyt T zabójca (killer T cell). Pierwsze, co taki limfocyt robi gdy rozpozna peptyd pochodzący z obcego białka, to wysłanie sygnału wyzwalającego w zainfekowanej komórce apoptozę – czyli zaprogramowaną śmierć komórki⁵.

Jak już pisałem geny są jak grupy krwi – mamy te same allele HLA z którymi się urodziliśmy. HLA kodowane są przez kilka genów (A, B, C i inne), a każdy z nich może mieć kilkadziesiąt alleli. Każdy z nas otrzymał jeden allel od mamy, a drugi od taty, i tak w przypadku każdego z tych genów. Kombinacja alleli jest niemal unikalna⁶.

Dlaczego jest tyle różnych alleli HLA? Inne geny nie mają tylu wariantów. Ludzie w ogóle są bardzo mało zmienni genetycznie; stosunkowo niedawno – w skali ewolucyjnej – populacja ludzi zmalała do zaledwie kilku, może kilkudziesięciu tysięcy osobników. Staliśmy się przez to gatunkiem niezwykle jednorodnym pod względem genetycznym – te wszystkie „rasy”, kolory skóry czy włosów to są z punktu widzenia genetyki naprawdę kosmetyczne różnice. Ale w przypadku HLA mamy całkiem sporo zmienności. Przyczyną jest prawdopodobnie dobór naturalny. Najwyraźniej posiadanie różnych wariantów genów HLA przynosi ewolucyjną korzyść – czyni nas bardziej odpornymi na choroby⁷. Im więcej różnych alleli posiadamy, tym więcej różnych peptydów pochodzących z białek wirusa czy nowotworu nasze komórki mogą prezentować na swojej powierzchni. Okazuje się, że allel allelowi nierówny.

Problem w tym, że takie białko powstałe z genu HLA musi złapać peptyd, żeby zaprezentować go później na powierzchni komórki, i okazuje się, że różne warianty w różnym stopniu rozpoznają różne peptydy. To z kolei przekłada się na skuteczność układu odpornościowego w walce z chorobą, to znaczy – w pewnych chorobach niektóre allele radzą sobie wyjątkowo dobrze, a niektóre – wyjątkowo źle. Na przykład, nosiciele allela HLA B*27 znacznie częściej potrafią samoistnie pozbyć się infekcji HCV. Najwyraźniej ten allel jest wyjątkowo dobry w wyłapywaniu pochodzących od wirusowych białek peptydów. Takie związki między zestawem posiadanych alleli HLA a chorobą pokazywano już wiele razy, więc narzucało się pytanie, czy istnieje taki związek również z Covidem.

No dobra, wróćmy do naszej pracy. Idea była bardzo prosta: sprawdzić, czy genotyp chorych – zestaw alleli HLA – jest związany z ciężkim przebiegiem choroby. Mieliśmy do dyspozycji świetnie opisaną kohortę chorych z berlińskiej kliniki uniwersyteckiej. Ciężką chorobę określaliśmy jako chorobę wymagającą intubacji (podłączenia do respiratora), wysoki poziom troponiny (białka, którego poziom we krwi wzrasta gdy organizm znajduje się w złym stanie) lub sam fakt, że chorujący znaleźli sie na oddziale intensywnej terapii (OIOMie, czyli ICU).

W naszej berlińskiej kohorcie było szereg alleli, które wydawały się mieć związek z chorobą. Na przykład allel C*04:01 występował u jednej piątej wszystkich pacjentów. Spośród osób, które nie mają tego allela, mniej więcej połowa trafiła na OIOM. Wśród pacjentów będących nosicielami C*04:01, na OIOM trafiły trzy czwarte. W przypadku intubacji różnice były jeszcze większe (jedna trzecia vs 70%). Na obrazku wygląda to tak:

Ciemniejszym kolorem zaznaczeni są pacjenci, którzy trafili na OIOM lub byli intubowani; niebieski oznacza OIOM, zielony intubację. Obok siebie są zawsze dwa słupki pokazujące liczby pacjentów, po lewej tych, którzy nie mają allela C*04:01, po prawej tych, którzy są jego nosicielami.

Oczywiście, te liczby są o wiele za małe by można było coś konkretnego powiedzieć, ale na szczęście
mieliśmy też współpracę z grupami ze Szwajcarii i Hiszpanii, które również dostarczyły nam próbek, oraz dostęp do już opublikowanych sekwencji próbek dostępnych w bazie danych GEO. W sumie mieliśmy więc trzy zestawy próbek. Niestety, mimo wszystko nadal było ich trochę mało, dlatego zdecydowałem się na etapowy schemat badania. Berlińską kohortę potraktowałem jako „eksploracyjną” (discovery cohort), służącą do wyboru kandydatów – alleli potencjalnie związanych z ciężkim przebiegiem choroby, które później sprawdzałem w pozostałych dwu zestawach danych. Na prowadzenie wyszedł allel C*04:01⁸. Zresztą, sami popatrzcie:

Jak widać, nic nie wyszło w danych z Hiszpanii i Szwajcarii (DS2), bo osób, które trafiły na OIOM było w tej grupie bardzo mało. Za to w danych ze USA (ściągniętych z bazy danych GEO) otrzymaliśmy dobre potwierdzenie naszych wyników. Nie jesteśmy też jedynymi, którzy zwrócili uwagę na ten allel. Już po napisaniu większości manuskryptu zauważyliśmy, że w jednym z wcześniejszych badań stwierdzono wyższą proporcję allela C*04:01 wśród wszystkich osób chorych na kowid. Allel C*04:01 ma też jakiś związek z HIV, chociaż nie jest do końca pewne, jak ten związek wygląda.

Mieliśmy cały szereg hipotez na temat powiązań alleli HLA z ciężkim przebiegiem kowida, część z nich udało nam się nawet przetestować. Niestety, nic ciekawego nie wyszło. Chociaż wyniki negatywne również powinno się publikować i włączyliśmy je do naszej pracy, nie ma sensu żebym się tu nad nimi rozwodził (np. nie ma związku między allelami a liczbą wykrytych cząstek wirusa).

W tym miejscu wypada mi wyliczyć wszystkie zastrzeżenia, jakie mam wobec własnej pracy. Po pierwsze: chwilowo macie do czynienia jedynie z preprintem, który nie przeszedł jeszcze przez sito recenzji. Oczywiście, wysłaliśmy już pracę do recenzji, dam znać gdy się gdzieś ukaże, ale na razie należy nasze odkrycie traktować z dużym dystansem. Niezależnie od tego, jak bardzo nam się wydaje, że jesteśmy krytyczni wobec siebie, nigdy nie będziemy tak krytyczni jak nasi recenzenci.

Po drugie, nasze badania są oparte na stosunkowo niewielkich grupach – byłbym bardziej pewien siebie, gdyby chodziło o tysiące, a nie setki pacjentów. W dodatku mniejsze grupy mogą oznaczać, że efekt wygląda na silniejszy niż jest w istocie. Po trzecie, w jednej z trzech grup, które badaliśmy (jak widzicie na obrazku powyżej) nie potwierdziliśmy efektu allela HLA C*04:01, mimo iż sam allel najbardziej w tej grupie występował. Sądzimy, że to przez bardzo niewielką liczbę osób, jaka w tej grupie trafiła na OIOM albo została intubowana, więc nie możemy wykluczyć, że efekt faktycznie również jest w tej populacji, ale nie mogliśmy go wykryć. Tym niemniej jednak nie da się wykluczyć innych wytłumaczeń. Ciągle jednak zbieramy nowe dane, być może będziemy mogli je umieścić w nowej wersji.

Po co więc zawracam Wam głowę, skoro sam mam tyle wątpliwości? Bo każda okazja jest dobra, żeby poopowiadać o HLA i układzie odpornościowym. No i oczywiście od tego jestem autorem, żeby wierzyć, że mam rację – głowy recenzentów w tym, żeby sprawdzić, czy rzeczywiście. Ale między nami mówiąc, będę bardziej pewien swego jeśli badania doczekają się niezależnego potwierdzenia.

A zakładając, że faktycznie HLA*C 04:01 ma związek z Covidem, to jakie ta praca ma praktyczne znaczenie? Po pierwsze, sam fakt że widzimy związek między HLA a ciężkim przebiegiem choroby jest ciekawy zarówno dlatego, że może pomóc wyjaśnić mechanizm tej choroby, jak i przez związki tego konkretnego allela z innymi chorobami. Na przykład allel C*04:01 ma związek z tajemniczą chorobą Kawasakiego. Jest to o tyle ciekawe, że objawy przypominające chorobę Kawasakiego zaobserwowano u dzieci zainfekowanych Sars-Cov-2. Oprócz tego akurat gen HLA C potrafi również oddziaływać z fascynującymi komórkami o uroczej nazwie „naturalni zabójcy” (natural killer cells, NK cells), które prawdopodobnie odgrywają też swoją rolę w kowidzie.

Po drugie, jeśli obserwowany przez nas związek się potwierdzi, to będzie łatwiej określać grupy ryzyka. Mam szczerą nadzieję, że nie będzie to już potrzebne, bo w najbliższych miesiącach dzięki szczepieniom pandemia odejdzie w niepamięć. Z drugiej strony, nigdy nie wiadomo, kiedy nadejdzie kolejny wariant koronawirusa czy innej cholery.

P.S. Dodam jeszcze jedno – zanim ktoś tryumfalnie odkryje moje „powiązania finansowe” z Big Pharma, badanie było finansowane częściowo przez Roche Sequencing Solutions. Firma zajmuje się nowymi technologiami badawczymi i jest zainteresowana wykorzystaniem ich w praktyce naukowej.

---

1. tzn. nasze komórki otoczone są podwójną warstewką tłuszczu, w której jest też mnóstwo „pływających” białek – stąd nazwa, „podwójna błona białkowo-lipidowa”. ↩
2. jak przeciwciała, z którymi zresztą są blisko spokrewnione. Każdy z nas posiada miliardy takich różnych wariantów. ↩
3. no chyba że rozpoznają, i wtedy mamy do czynienia z chorobą autoimmunologiczną; znanym przykładem jest reumatoidalne zapalenie stawów. Jak to się dzieje, że nie rozpoznają, to jedna z najbardziej fascynujących historii związanych z naszym układem odpornościowym, i zbieram się od dawna, żeby ją opowiedzieć, tutaj tylko skrót: przeciwciała i receptory komórek T powstają w drodze losowych rekombinacji na długo zanim w organizmie pojawi się antygen, który rozpoznają. Oczywiście w drodze tych losowych rekombinacji powstają też przeciwciała rozpoznające białka występujące w organizmie, które mogłyby prowadzić do schorzeń autoimmunologicznych. Dlatego limfocyty T i B przechodzą przez sito selekcji klonalnej, który eliminuje (nie zawsze wystarczająco dokładnie) wszystkie komórki, które produkują przeciwciała bądź receptory rozpoznające własne białka. ↩
4. OK, jeśli znacie immunologię to wiecie, że prześlizguję się tu nad niezmiernie ważną kwestią istnienia dwóch typów kompleksu MHC: I i II. To co piszę głównie dotyczy tego pierwszego. Ten drugi występuje na powierzchni komórek prezentujących białka, które wcześniej „zjadły”, np. makrofagów prezentujących białka strawionych przez nie bakterii. MHC II jest rozpoznawane przez limfocyty T CD4+ („komórki T pomocnicze”, „T helper cells”), MHC I przez limfocyty T CD8+ („komórki T cytotoksyczne”, „killer T cells”). ↩
5. Wyzwolenie sygnału apoptozy jest tylko jedną z funkcji komórki T cytotoksycznej. Aktywowana komórka Tc zaczyna się dzielić – w ten sposób pojawia się coraz więcej komórek Tc, z których każda niesie receptor zdolny rozpoznać antygen konkretnego wirusa. Część tych potomnych komórek zamienia się jednak w komórki pamięci – i dzięki temu pamięć o antygenach wirusa przetrwa infekcję. Chciałem narysować Schwarzeneggera Terminatora jako „T-killer”, ale mi nie wyszło. ↩
6. Komórki T reagują gwałtownie nie tylko na obce peptydy, ale również na obce allele HLA. Dlatego właśnie mówimy o „ludzkim antygenie leukocytarnym”, human leukocyte antigen, czyli HLA. I dlatego właśnie przy przeszczepach ważna jest zgodność alleli HLA – stąd właśnie poszukiwanie dawców. A dlaczego w takim razie nie trzeba tej zgodności badać przy przetaczaniu krwi? No bo czerwone krwinki należą do nielicznych komórek w naszym ciele które nie mają na swojej powierzchni kompleksu MHC (mają za to inne geny, np. gen o nazwie ABO, których różne allele odpowiedzialne są za grupy krwi). ↩
7. Jest też inne wyjaśnienie: chodzi o dobór zależny od częstości. Tzn. kiedy jakiś allel HLA rozprzestrzenia się w populacji, bo wyjątkowo dobrze rozpoznaje białka pewnego wirusa, to presja doboru naturalnego sprawi, że mutacje wirusa nierozpoznawane przez allel zaczną znikać z populacji. Wówczas korzyść z posiadania allela zmaleje, i tak ad inifinitum. ↩
8. po poprawce na wielokrotne testowanie, p < 0.004. ↩